目的：建立简单快速鉴别蛤蚧的特异性PCR方法。方法：对比蛤蚧及其伪品细胞色素C氧化酶I亚基基因（COⅠ)序列，设计蛤蚧特异性PCR鉴别引物，优化特异性PCR条件，对蛤蚧及其7种常见混淆品进行扩增及荧光检测。结果：扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和荧光检测，所有蛤蚧药材均能扩增出约bp的特异性条带，加入SYBRGreenI染料后，在nm下出现强烈绿色荧光，混伪品不具特异条带和绿色荧光，鉴别操作可在30min内完成。结论：快速PCR结合荧光染料检测可快速鉴别蛤蚧及其常见伪品，为蛤蚧的快速鉴定提供了新的思路和方法。

快速PCR技术鉴别中药材蛤蚧的方法研究

蒋超1，赵群2，金艳1，袁媛1*，，赵玉洋1

1.中国中医科学院中药资源中心，北京;

2.皖西学院化学与生命科学系，安徽六安

中药蛤蚧来源于壁虎科动物蛤蚧GekkogeckoLinnaeus.的干燥体，在临床上主要用于肺肾不足、虚喘气促、劳嗽咳血等。以蛤蚧为主要原料的中成药，如蛤蚧精、蛤蚧补肾丸、蛤蚧定喘丸等应用广泛，用量甚大。近年来随着蛤蚧资源的缩减，蛤蚧伪品时有出现，市场上出现过的蛤蚧伪品多达18种，包括东方蝾螈、中国瘰螈、变色树蜥、无蹼壁虎、多疣壁虎、红螺疣螈、喜山岩蜥、青海沙晰、石龙子、变色沙晰等[1-3]。对其中一些品种，蛤蚧正品与之形态学特征差别细微，传统的方法难以对其药材进行鉴定[4]。为确保药材市场中蛤蚧的质量及其伍床疗效，需要建立快速、准确的方法进行鉴定。分子生物学技术的发展为动物类中药的鉴别提供了新的技术于段，尤其是特异性PCR技术，因其客观、准确的优点已用于蛤蚧[2]、蛇类[5-6]、鹿茸[7]、蛤蟆油[8]等动物类中药的真伪鉴别。然而相对传统方法其实验周期较长，特别是完成PCR反应后还需电泳与成像等步骤，严重制约了分子鉴定技术的进一步应用。快速PCR是在特异性PCR技术基础上的进一步发展，通过结合DNA快速提取[9]、快速PCR扩增和荧光检测技术，能在30-40min内实现真伪鉴别。快速PCR技术自从在金银花[10]和蛇类药材[11]应用以来快速发展，已用于鱼腥草[12]、杜仲[13]、西红花[14]、绞股蓝[15]、人参[16]、艾纳香[17]、菟丝子[18]等中药的真伪鉴定与质量控制。本研究拟通过利用碱裂解法快速提取DNA，优化特异性PCR反应程序，进行快速扩增，结合SYBRGreenⅠ荧光染料对真伪鉴别结果进行肉眼检测，将蛤阶PCR鉴制时间控制在40min内，为实现蛤阶的现场DNA分子鉴别提供技术保障。

1仪器与试药

1.1仪器

PCR仪:VeritiTM型(AppliedBiosystem公司)、GeneAmp型(AppliedBiosystem公司)、PTC-型(Gene公司)、TC-型(Techne公司)、Mastercycler型(Eppendorf公司);R型高速冷冻离心机(Eppendorf公司);VORTEX-2GENIE旋涡震荡仪(Scientificindustries公司);P0werPacTM型电泳仪(Bio-Rad公司);HE99X-15-1.5型电泳槽(Hoefer公司);SYNGENE凝胶成像系统(GENE公司);WD-C型紫外仪(北京市六一仪器厂)。

2.2材料

选取来自于不同产地的蛤蚧正品及7种蛤蚧类伪品共79份材料进行快速PCR鉴别研究。样品采自安徽毫州、广西玉林、成都荷花池等药材市场，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心。见表1。

1.3试剂

不同特性TaqDNA聚合酶:低保真的rTaq(Takara公司)、中度保真的SpeedStarHSTaq(Takara公司)、高度保真的Q5TaqDNA聚合酶(NEB公司);1-52xHigh-FidelityMasterMix预混液(北京擎科新业生物技术有限公司);琼脂糖(Promega公司);溴化乙啶(Fluka公司);DLDNAMarker(Takara公司);00xSYBRGreenⅠ(Invitrogen公司);其他试剂均为国产分析纯。

2方法

2.1引物设计

2.1.1序列比对

从NCBⅠ数据库(NationalCenterforBiotechnologyInformation)中下载蛤蚧(HM.1、F.1)及其可能的伪品东方蝾螈(CynopsorientalisEU.1)、变色树蜥(KC.1)、无蹼壁虎(EU.1)、中国壁虎(GekkochinensisKP.1)、青海沙蜥(PhrynocephalusvlangaliiKF.1)、喜山岩蜥(LaudakiahimalayanaHM.1)、变色沙蜥(KF.1)、丽斑麻蜥(HQ.1)的COⅠ序列，对于网上无序列的中国瘰螈、红瘰疣螈、中国石龙子样品和蛤蚧正品使用通用引物LCOⅠ/HC，按照标准程序(见表2)进行扩增，并进行双向测序，序列经拼接后与下载的序列一起利用ClustalW程序进行多重序列比对，选择蛤蚧与其伪品差异大的区域进行引物设计。

2.1.2引物设计

使PremierPrimer5.0(







































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