DNA胞嘧啶残基（C）的遗传修饰可通过调控基因转录在发育过程中发挥重要作用。目前，研究最多的胞嘧啶修饰形式是与抑制基因表达有关的5-甲基胞嘧啶（5mC）。在5mC去甲基化过程中，5mC会呈现包括5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲胞嘧啶（5fC）和5-羧胞嘧啶（5caC）等中间状态，其中某些5hmC在细胞周期中可以是稳定的表观遗传标记。

已有研究发现，5hmC除了在去甲基化过程中充当“中间物”之外，还可能有多种独立的功能。例如，5hmC变化与神经发育有关，可能是转录激活的标志，具有作为不同人类癌症类型和其它复杂疾病生物标记物的潜力。

来自美国芝加哥大学的何川教授团队认为，了解不同人类组织类型的5hmC全基因组分布情况，可以加强对5hmC在正常组织中的调控和人类疾病中失调的理解。基于此，其团队开展了相关研究，利用5hmC-seal法和NGS构建了广泛的人体组织5hmC图谱，并评估了5hmC富集区域的调控和组织特异性。该研究结果已发表在NatureCommunications上。

研究内容与结果

人体主要器官组织的全基因组5hmC图谱

为了构建广泛的全基因组5hmC图谱，该研究收集了十个主要器官系统（神经系统、心血管系统、消化系统、生殖系统、内分泌系统、呼吸系统、泌尿系统、皮肤系统、骨骼系统和淋巴系统）的19种组织类型，共计96例样本。其中79例来自非癌性器官，17例来自切除肿瘤后的正常邻近组织，并对生成的5hmC-seal文库进行测序。

对19种组织中HOXA基因簇5hmC水平的分析结果表明，5hmC富集水平因组织类型而异，特别是在远相关组织之间（如大脑和肾脏）。另一方面，在相同组织类型的供体样本中，5hmC的富集似乎高度一致。同时，该研究的数据集和TAB-seq等单碱基解析方法提供的5hmC谱之间具有高相关性。同时，5hmC-seal信号和局部CpG密度的比较显示没有相关性，证实了该研究在不同组织中获得的全基因组5hmC图谱的准确性和可重复性。

图2.19种组织中HOXA基因簇的5hmC基因组分布。来源：NatureCommunications

人体各组织中5hmC分布特征

在建立数据集之后，研究团队分析了5hmC在不同功能区域的分布，以确定不同组织中5hmC富集的共同特征。结果显示，在19种组织类型中，5hmC在TSSs（转录起始位点）缺失，在启动子和基因体（即转录单位）富集，而在基因内其它区域则较少。该结果支持了此前5hmC是转录活性和基因激活标志的假设。

同时，t-SNE聚类分析结果表明，5hmC显示出较高的组织间特异性，其分布及功能与发育相关的组织紧密程度相关。例如，中枢神经系统的大脑和下丘脑有相似的5hmC分布。通过对8个代表性组织（乙状结肠、心脏、肝脏、肺、卵巢、胰腺、胎盘和胃）评估5hmC的分布和染色质状态，发现5hmC在8种组织类型中都显示出相似的分布模式。

此外，该研究还分析了7个组织（即乙状结肠、心脏、肝脏、肺、卵巢、胰腺和胃）的全基因组重亚硫酸氢盐测序数据（WGBS），并定义了几个区域，分别为：DNA甲基化峡谷（3.5kb的未甲基化区域）；控制未甲基化区域（cUMR,1-3.5kb区域内未甲基化）；部分甲基化区域（PMD,有较高甲基化水平的数百kb区域）；低甲基化区域（LMR,在-0bp区域内小于30个CpG岛）。

分析发现，5hmC优先富集在甲基化峡谷和cUMRs的边缘，而不是定位在这些区域的中心，说明这些区域有活跃的去甲基化行为。相反，5hmC基因座很少在PMDs的边缘或中心发现，提示这些异染色质区域很少或没有活跃的去甲基化行为。此外，在LMR中心观察到高5hmC丰度，表明5hmC在远端调控位点上富集。以上数据表明，5hmC优先分布在基因组活跃区域，在转录调控中具有潜在的意义。

图4.基于重亚硫酸氢盐测序的5hmC信号。来源：NatureCommunications

组织特异性5hmC修饰功能基因

为分析5hmC修饰是否标记了组织特异性基因，研究人员共检测到个组织特异性5hmC修饰基因，识别了基于组织特异性的5hmC修饰基因的基因通路，发现这些通路反映了组织特异性功能，并且5hmC密度与组织特异性基因的转录高度相关。

研究人员利用RNA-seq从用于5hmC-Seal分析的96份样本中生成了基因表达谱。结果表明，除了肺和睾丸样本中很少有组织特异性5hmc修饰基因，其余均显示组织特异性5hmC与基因表达高度一致。值得注意的是，5hmC分布可以很容易地区分不同的组织类型。在所有样本组织中，基因体5hmC与相应转录本的水平呈正相关，表明基因水平的5hmC修饰可以反映基因在不同人体组织中的表达状态。研究团队认为，对于进行主动转录调控的基因，5hmC谱可能比基因表达谱更相关。

此外，全基因组分析结果显示，5hmC比以H3K27ac和H3K4me1为标记的经典增强子更富含组织特异性。5hmC或可作为一种更好的组织特异性生物标志物应用于组织类型分类。

结语

该研究成功绘制了不同人体组织类型的5hmC图谱，并在19种组织类型中，证实了5hmC修饰在非疾病人类器官系统中的组织特异性基因和增强子上的重要作用。不仅提供了全面的基因组5hmC分布的数据资源，描绘了主要人体组织中组织特异性的5hmC修饰区域，还为将5hmC修饰作为新型表观遗传标记用于人类发育和疾病进展的临床应用提供了理论支撑。